FORTEBIO的生物邏輯

我們(men) 的使命驅使我們(men) 盡一切可能開發出可以治愈疾病的重要生物製劑。通過提供客戶的產(chan) 品，了解客戶研究背後的科學知識，提供的服務以及成為(wei) 尋找研究挑戰解決(jue) 方案的可信賴合作夥(huo) 伴，我們(men) 可以使客戶擺脫工作流程的瓶頸。

FORTEBIO 抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳(chuan) 感器

抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳(chuan) 感器

-動力學等級

用於(yu) 蛋白結合產(chan) 物無標記檢測的 Octet 生物傳(chuan) 感器代碼：18-5060，18-5061

開始試驗前，請完整讀取整個(ge) 產(chan) 品說明書(shu) 。僅(jin) 供研究使用，不用於(yu) 診斷程序。

O 垂直

抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳(chuan) 感器能夠將人 IgG 或其他含有人 Fc 區的蛋白固定在生物傳(chuan) 感器表麵。固定化蛋白可用於(yu) 後續的動力學相互作用分析。事件  AHC 生物傳(chuan) 感器的表麵設計為(wei) 提供穩定的相互作用，使其適用於(yu) 苛刻的動力學應用。

  INTE 編號US E

ForteBio 抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳(chuan) 感器，結合 Octet QK 係統或 Octet RED 係統，設計用於(yu) 大分子相互作用的動力學分析。AHC 生物傳(chuan) 感器可用於(yu) 許多樣品類型，包括純化蛋白、細胞培養(yang) 上清液和細胞裂解物。

  P RI NCI PL E

使用抗人 IgG Fc 部分的高親(qin) 和力抗體(ti) 預固定抗人 IgG 捕獲 (AHC) 生物傳(chuan) 感器。該抗體(ti) 可捕獲並固定人 IgG (hIgG) 或其他含 Fc 配體(ti) ，以產(chan) 生適用於(yu) 相互作用分析的穩定表麵。捕獲表麵特別適用於(yu) 固定細胞培養(yang) 上清液或其他複雜混合物中的 hIgG，其中生物素化不是一個(ge) 選擇。

AHC 生物傳(chuan) 感器經設計可耐受典型再生條件。在典型工作流程中，這允許捕獲目標 hIgG，分析人 IgG 與(yu) 其分析物的結合，然後表麵再生至其原始狀態。然後可以通過加載新的人 IgG 重複使用生物傳(chuan) 感器。

K I T C 打開

Octet QK 和 Octet RED 係統的抗人 IgG 捕獲生物傳(chuan) 感器包含：

將生物傳(chuan) 感器儲(chu) 存在室溫下的幹燥處，避免陽光直射。將生物傳(chuan) 感器作為(wei) 銳器處置。收到後，生物傳(chuan) 感器可穩定儲(chu) 存 6 個(ge) 月。

10x 動力學緩衝(chong) 液-10 mM 磷酸鹽、150 mM NaCl、0.02% 吐溫 20、0.05% 疊氮化納、1 mg/mL BSA (pH 7.4)。在 2-8 ℃ 下儲(chu) 存直至失效。

  A DDITIO 編號M後結果R 等效 E D

需要以下附加材料：

• 人 IgG-可固定人 IgG 或其他含人 Fc 的蛋白。人 IgG 可以是純的，也可以是複雜混合物（如培養物上清液）的一部分。
• 調節/再生溶液-10 mM 甘氨酸 pH 值

表麵處理和再生需要 1.7。根據固定分子，可能需要進一步優(you) 化 pH 值。

• 相互作用蛋白
• 試驗緩衝液-推薦 1X Kinetics 緩衝液（用 PBS (pH 7.4) 以 1:10 稀釋 10X Kinetics 緩衝液）。可使用其他緩衝液。在整個生物傳感器水合和所有測定步驟中，緩衝液保持一致時觀察到的結果。
• Octet QK 係統或 Octet RED 係統
• 96 孔微孔板-2 X 96 孔、黑色平底聚丙烯微孔板 (Greiner Bio-one#655209)

T EC HN IQUE SFO RO PTIMA LP ER FO RM AN CE

1. 在加載步驟之前，需要對生物傳感器進行調節，以改善基線和表麵穩定性。通常調節包括 3 X 20 秒暴露於再生緩衝液和 1X 動力學緩衝液交替。
2. 對於嚴格的應用，建議使用由結合和再生循環組成的生物傳感器表麵的“主要”。該預充結合循環應包括從溶液中捕獲 hIgG，然後使用再生方案再生回原始表麵。應在表麵處理後進行預充。
3. 通常，生物傳感器表麵的再生可以通過 5 X 5 秒暴露於 10 mM 甘氨酸 pH 1.7 與 1X 動力學緩衝液交替實現。在某些情況下，可能需要根據 hIgG 進一步優化再生。
4. 為了獲得良好性能，應包括一個參考生物傳感器。參比生物傳感器應加載 hIgG，並應使用用於結合和解離步驟的緩衝液空白運行。
5. 製備前，將試劑和樣本平衡至室溫。對於冷凍樣本，使用前解凍並充分混合。
6. 在 Octet 係統上進行測定前，需要對生物傳感器進行水合。生物傳感器在與整個試驗過程中使用的緩衝液一致的緩衝液中水合將得到穩定的結果。
7. 檢測樣本和生物傳感器水合溶液所需的小體積均為 200 μL/孔。
8. 確保 Octet 儀器打開，並在開始測定前將燈預熱至室溫至少 40 min。
9. 選擇文件 <unk>，在 Octet 軟件中設置樣品板溫度 實驗 <unk>  設置板溫度。輸入  所需溫度。ForteBio 建議測定  在 30 °C 下測定。在其他溫度下測定可能需要與本方案中討論的不同的測定時間。

  P RO 至 CO LO 垂直

1. 製備緩衝液、再生溶液、配體和相互作用的蛋白樣品。
2. 移取 200 μL 適當的水合溶液，置於 96 孔板中。將水合板插入，然後將生物傳感器置於生物傳感器托盤上，以水合生物傳感器。
3. 將 200 μL 各適當樣品或緩衝液轉移至 96 孔板的適當孔中。
4. 在 Octet 儀器上平衡水合生物傳感器組件和樣品板 10 min。
5. 開始試驗。
6. 進行數據分析並保存結果。

  S AMPL EP RE PA RA TI ON

製備前將試劑和樣本平衡至室溫，並充分混合。

1. 人 IgG 或其他含 Fc 配體– 配體是固定在生物傳感器表麵的蛋白質。含 Fc 配體的典型固定濃度為 5-25µg/mL。每個孔需要 200µL 配體。試驗後可從微孔中回收配體溶液，並根據需要重複使用。

如果從(cong) 細胞培養(yang) 上清液中捕獲配體(ti) ，如果用 1X Kinetics 緩衝(chong) 液將上清液以至少 1:2 稀釋，則可獲得宜結果。如果該稀釋導致配體(ti) 的總濃度較低，則生物傳(chuan) 感器可與(yu) 細胞培養(yang) 物在 4 C 下孵育過夜，以使含配體(ti) 的 Fc 的上樣量大化。關(guan) 於(yu) 過夜裝載的提示，請參見  技術說明TN3010_ 鏈黴親(qin) 和素批次固定.

1. 相互作用蛋白-在嚴格的動力學分析期間，建議運行至少 4 種不同濃度的

   以稀釋係列形式相互作用的蛋白質。高濃度應比預期 KD 高約 10 倍。例如，對於(yu) 預期具有低 nM 親(qin) 和力的相互作用，相互作用蛋白的濃度 90 nM、30 nM、10 nM 和 3 nM 通常可提供良好的動力學數據。每份樣品需要 200µL 蛋白溶液的微孔體(ti) 積。

   對於(yu) 篩選試驗或定性相互作用分析，相互作用蛋白的單一濃度足以表征結合。

2. 調節/再生溶液-抗人 IgG 捕獲生物傳感器可通過使用 10 mM 甘氨酸 (pH 1.7) 再生至捕獲表麵水平。再生後，生物傳感器可重新加載 hIgG，用於新的相互作用分析。在重複再生中觀察到結合力的小幅損失。為了穩定表麵，建議執行初始調節步驟。該調節包括在*相互作用試驗前將生物傳感器暴露於再生緩衝液。

3. 對於(yu) 分析的特定 hIgG/相互作用蛋白，可能需要進一步優(you) 化調節/再生溶液的 pH 值。

   O 尼龍 EIMMOBILIZATIO NP RO 至 CO L

   以下是在線固定中使用的典型檢測步驟列表。這些步驟由 Octet 係統*自動化。

4. 基線（通常為 1X 動力學緩衝液或培養基樣品）
5. 處理（推薦）。將生物傳感器暴露於再生溶液，以優化基線性能並穩定麵密度。
6. 預充綁定循環（可選）
7. 配體上樣（通常為 1X 動力學緩衝液或培養基樣品）
8. 基線（通常為 1X 動力學緩衝液）
9. 相互作用蛋白的關聯（通常為 1X 動力學緩衝液）
10. 解離（通常為 1X 動力學緩衝液）
11. 再生（10 mM 甘氨酸，pH 1.7）

12.  

13. 試驗準備 - 按照上述樣品製備章節所述，製備緩衝液、再生溶液、配體和相互作用蛋白。

14.  

15. 測定板 - 根據表 1 中的微孔板分布圖，將 200 μL 各檢測試劑轉移至 96 孔黑色平底聚丙烯微孔板中。

16.  

    	1	2	3	4	5	6	7
    A	緩衝(chong) 液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩衝(chong) 液	hIgG 或 Fc-配體(ti)	緩衝(chong) 液	相互作用蛋白	緩衝(chong) 液
    B	緩衝(chong) 液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩衝(chong) 液	hIgG 或 Fc-配體(ti)	緩衝(chong) 液	相互作用蛋白	緩衝(chong) 液
    C	緩衝(chong) 液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩衝(chong) 液	hIgG 或 Fc-配體(ti)	緩衝(chong) 液	相互作用蛋白	緩衝(chong) 液
    	… …	…	…	…	…	…	…
    H	緩衝(chong) 液	10 mM 甘氨酸 pH 1.7	緩衝(chong) 液	hIgG 或 Fc-配體(ti)	緩衝(chong) 液	緩衝(chong) 液	緩衝(chong) 液

    表 1.接骨板分布圖示例。

     

    生物傳(chuan) 感器水化板製備-小心地從(cong) 生物傳(chuan) 感器托盤組件上取下黃色生物傳(chuan) 感器架的頂部，並放置在工作台上。將黑色 96 孔板牢固地放置在藍色生物傳(chuan) 感器托盤支架中。將 200 μL 水合溶液轉移到微孔板中與(yu) 正在使用的生物傳(chuan) 感器的數量和位置相匹配的每個(ge) 孔中。高度

    建議在整個(ge) 試驗過程中使用的相同緩衝(chong) 液中水合生物傳(chuan) 感器。

     

    將生物傳(chuan) 感器架與(yu) 水合板對齊，更換生物傳(chuan) 感器架，注意不要刮擦或接觸生物傳(chuan) 感器底部。至少水合生物傳(chuan) 感器至關(guan) 重要10 min在 Octet QK 係統或 Octet RED 係統上。

17. 生物傳感器和樣品板的儀器放置-將帶有 A1 的樣品板朝向 Octet QK 儀器或 Octet RED 儀器中樣品板載物台的右後角放置。

18. 將生物傳(chuan) 感器托盤放在 Octet 儀(yi) 器左手側(ce) 的生物傳(chuan) 感器平板台上。

    確保生物傳(chuan) 感器托盤和樣品板均牢固就位。進入“儀(yi) 器準備和編程”。

      I結構 TPRE pa RA TI Ona daP RO GR AM IN G

    確保 Octet 儀(yi) 器及其計算機已打開。必須將燈預熱至少 40 min。

    雙擊 Octet User Software 圖標     並允許 Octet 完成初始化。從(cong) 菜單中選擇實驗

    è    新   動力學  實驗  (Ctrl + K) . 按照以下順序填寫(xie) 每個(ge) 選項卡所需的信息：

     

        傳感器 <-> 樣本分配

19. 使用鼠標突出顯示生物傳感器板中使用的傳感器（方塊）。傳感器信息可直接輸入表格。
20. 使用鼠標突出顯示含有樣本或試劑的孔。可將樣本信息直接輸入表格。
21. 輸入相互作用蛋白的濃度值。
22. 點擊“+“或“添加”執行測定所需的測定步驟數。
23. 定義每個測定步驟。
    1. 在“數據名稱”下，雙擊更改步驟名稱
    2. 分析時間
    3. 在“流速”項下，輸入軌道流量振蕩器的 rpm。所有動力學步驟（基線、締合和解離步驟）均應在 1000 rpm 流速下進行。
    4. 在“類型”下，從下拉菜單中選擇步驟類型。
24. 通過按應執行的順序分配生物傳感器、樣本及其相關試驗步驟，創建試驗方案。
    1. 點擊包含您希望使用的生物傳感器的列，選擇生物傳感器列。
    2. 從以下選項中選擇個定義的測定步驟步驟數據設置單擊該表。

25. 雙擊選定步驟中要使用的樣品列。該步驟將顯示在“檢定係統設置列表”中

     

        檢測定義

    在表 2 中，“步驟數據設置”是帶有相關(guan) 參數的可編程步驟的示例列表。下表列出了典型檢測的步驟順序。

    如果運行啟動結合循環，則在上樣含配體(ti) 的人 IgG 或 Fc（步驟 9）後，通過 5 次再生循環再生生物傳(chuan) 感器。啟動後，生物傳(chuan) 感器應重新加載含配體(ti) 的人 IgG 或 Fc，並從(cong) 步驟 8 開始運行試驗。

1. 在選擇下一列生物傳感器之前，完成剩餘試驗步驟。

表 2.檢測步驟和相關(guan) 參數示例。再生後，重複步驟 8-22 以重新加載並進行下一次試驗。* 在 Octet QK 上，使用 Regen 步驟類型。在 Octet RED 上，使用自定義(yi) 步驟類型。

    運行實驗

1. 選擇瀏覽按鈕，保存原始數據的位置。強烈建議將數據保存到本地驅動器 (C:/)。運行完成後，可將數據傳輸至網絡驅動器。
2. 輸入實驗運行名稱（子目錄），其為所有原始數據文件和與實驗相關的實時綁定圖表創建一個新文件夾。  如果默認名稱不可接受，輸入板名稱。
3. 勾選“延遲實驗開始框”。輸入 300 秒，使樣品達到測定溫度所需的平衡時間為 5 min。
4. 默認設置將確保自動保存運行時圖表。
5. 點擊開始試驗.