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RNA- STAT 60說明書

　更新時間：2021-02-08　點擊量：1754

 

RNA- STAT 60說明書(shu)

從(cong) 同一樣品中分離總RNA/mRNA和的兩(liang) 種單提取試劑

 

目錄號編號TL-4100 僅(jin) 供fN.

引言
 

RNA/分離和RNA- STAT 60的整個(ge) 過程可以在90 min內(nei) 完成。這些是從(cong) 同一樣品中提取RNA和的有效方法。未降解RNA和的回收  比任何其他等化方法大30-150%。

應用

RNA- STAT 60分離的總RNA/為(wei)  用於(yu) Northern和Southern分析的是，斑點雜交，poly A + 選擇，體(ti) 外反式ltio n，RNase保護分析，分子克隆，以及來自人，動物和植物的組織的polyme rase鏈式反應，沒有任何額外的RNase/DNase處理。這些簡單的單一試劑是我們(men) 的一大優(you) 勢。使用本品時，RNA/的回收效率較高  從(cong) 小的生物樣本(biop sies etc.)中分離RNA/。

試劑供應

RNA STAT-60和 STAT-60

 

準備：即用型。

 

儲(chu) 存：2-8 ℃冷藏。

 

穩定性：參見la bel上的失效日期。

 

需要但未提供的試劑

 

氯方（ACS級）、異丙醇（ACS級）和乙醇（ACS級）。

 

方案

 

通過RNA- STAT 60方法分離RNA/包括以下步驟：

 

  1. 在RNA STAT 60中均質化

（1 ml/50-100 mg組織，或5-10 xI0 6ce lls）

 

  1. RNA提取：0.2 mL氯芬/ml勻漿。

 

  1. RNA精密度：0.5 mL異丙醇（歐洲藥典）  ml  初始檢測中使用的RNA ST AT 60。

 

4 . RNA Was h: 75% ethanol

除非另有說明，否則該程序在室溫下進行。

  1. 均質化：

 

  1. 組織：

 

Homogenize t iss ue samples in the RNA ST AT-60 (1ml

/根據50-IOOmg組織），置於(yu) 玻璃-聚四氟乙烯或Polytron勻漿器中。  樣品  體(ti) 積  應  不  過量   所用RNA ST AT-60體(ti) 積的l0%  用於(yu) 均質化。

 

  1. 細胞：

 

細胞  生長的  in  單眼  a重新裂解  凹凸的   in   通過加入RNA STAT-6 QTM(l ml/3.5 cm2 petri dis h)並通過細胞溶解物的培養(yang) 皿。  I 0 - 20  時間  用吸管粗暴吸管。懸浮生長的細胞  是   沉澱，然後在  RNA ST AT-60TM  ( l  ml/  5-JO x  106 ce lls）  by  重複的  移液。  洗滌   皮膚   加入前  of  的  RNA  STAT-6 QTM should  be  避免   增加了RNA降解的可能性。

 

  1. RNA延伸反應：

 

使均質化，  存儲(chu)  的  勻漿  te  針對  室溫下5 min，使其*解離  of  核蛋白  複合物。  下一步，添加  0.2  ml  氯方  依據  ml  of   的   RNA   STAT-60™。   蓋上樣品蓋，用力搖晃  針對  1 5  秒  o nds和  le t檢驗   it   s ta nd   at   房間   溫度    針對    2-3    分鍾。離心機  的  勻漿   at   12,000g   （大值）   針對   15分鍾  at  4°  C.以下  離心   第e次勻漿  半配對  進入  二  階段：   a   下限   紅酚氯方相和無色上層  水相。RNA在水相中保持著不透明的狀態，而和  蛋白質類  是  in  的  在三相和有機相中。溶液的體(ti) 積  水  相  約為(wei) 勻漿使用的RNA STAT-60TM體(ti) 積的60%。

 

  1. RNA沉澱：

 

傳(chuan) 輸  的  曲菌的  相  to  a  fres h  試管。  添加  0.5   ml異丙醇/ml或用於(yu) 勻漿的RNA STAT-60TM   和   混合。   儲(chu) 存   樣品    at    室溫下離心5-10 min  at  1200 0g（大），10 min，4 °C。RNA沉澱（離心離子前不可見），因為(wei) 在管底部有白色沉澱。


 

除去上清液，清洗RNA沉澱  一次  含75%乙醇  l  by  渦旋  和  後續  以7.500g（大值）離心5 min  4°  C.  添加  at  病變  I  ml 75%乙醇/ml  的  RNA  STAT-60TM  使用  對於(yu) 初始均質化。

程序結束時，短暫幹燥RNA沉澱(5-10 min)。重要的是不要使RNA沉澱*幹燥，因為(wei) 它將大大  減少  it  溶解度。  請勿使用  用於(yu) 幹燥的Speed-Vac。溶解RNA  水或(l mM)EDTA中沉澱。pH 7。或0.5%SDS溶液。渦旋或使團塊通過  a  很少  次  通過  a  移液器吸頭。可能需要在55-60 ℃下孵育10-15 min以溶解RNA。經焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的無RNase溶液  be  使用  對於(yu) RNA的如此輕浮。

 

  1. 預期收率和純度：

總RNA的預期yie ld：

 

  1. 毒性（µg/mg組織）：活r，脾髒，7-10µg；悉尼，3-4µg；腦骨骼肌，1-1.5µg；胎盤1-4

µg .

 

  1. 培養細胞(pe r/10 6ce lls)：上皮細胞，10-15 tg。成纖維細胞，5-7µg。

總RNA的終製備液不含  和蛋白質，260/280比值 > 1.8。

 

  1. 注釋和評論：

I. 對於(yu) 少量細胞或組織(1-10 mg)的RNA同分異構體(ti) ：將樣品在0.8 mL tl1e RNA ST AT-6QTM中勻漿，將勻漿轉移至Eppendorf管中，並遵循isola ti on方案。RNA沉澱應在-20 ℃下進行30 min的離子除外。需要添加載體(ti) r，如糖原。

 

  1. 以下   均質化離子   （之前    添加    的氯方）樣品可在-70 ℃保存至少2周。

 

  1. 在酶譜分析中，可能需要加入itiona l沉澱以使用由RNA STAT-60TM等長的RNA。如此lubili化後，在0.2 MNaCl和2倍體積乙醇l存在下沉澱RNA，用於  在-20 °C下15 min。PCR和RNase保護試驗不需要這種傳統的沉澱。

 

  1. 手和灰塵可能是RNase汙染的主要來源。使用手套並保持試管密閉。在整個過程中建議使用steri le,disposab le聚丙烯管。

 

RNA STAT-60TM co ntains the poiso n(pheno l)and the irritant(guan idiniu m).可能致命。當使用RNA STAT-6 QTM時，使用手套和護目鏡（護罩、護目鏡）。請勿接觸皮膚或衣物。避免吸入蒸汽。同時閱讀藥瓶上的警告說明。請勿將RNA STAT-60TM暴露於(yu) 強烈的酸性溶液中。

方案對象     反向   從用於RNA提取的樣品中提取

 

反向提取

 

取出後  的  水  層包含  RNA，  添加  800 μL STAT-60試劑/ml RNAzol。RNAzol B或RNA STAT-60  使用  針對  的  初始  均質化離子。添加  0.2 mL氯芬/ml    STAT-60、  奶昔  用力靜置15秒，然後在室溫下靜置  溫度  針對  2-3 min。在4 ℃下以2000 g（小值）-12000 g（大值）離心勻漿15 min。  滲出性  同源nate分為(wei) 2個(ge) 相：  a  下部器官ic  相和上層水相。保留在水相中，而蛋白質處於(yu) 間期和有機相中。

 

製備

 

轉換器  的  水溶液  相  to   a   新鮮的   管   和   混合   含異丙醇。每毫升加入0.5 mL異丙醇  of  的  使用的 STAT-60  針對  均質化。  Sto re  樣品s  at  -20°C  30 min，離心機  12,000g  （大值）  針對  LO  分鍾  4 °C下。  沉澱  翅  小  澄清  to  白色  微丸  在底部  of  的  試管。  委托方  小樣本，  添加  of  a  可能需要載體(ti) (g lycoge n)d。

 

洗滌

 

除去上清液，用75%乙醇渦旋清洗沉澱一次，隨後在4 ℃下以7,500g（多）離心5 min。按照1 mL 75%乙醇  ml   of   的      STAT-60   使用   針對   的   初始  同質尼紮離子。

 

在程序結束時，通過風幹(5-10 min)幹燥簡單的團塊很重要，不要使團塊過度幹燥，因為(wei) 它將大大降低其如此的柔韌性。將沉澱溶於(yu) 水或1 mm edta(pH 8.Vo rtex)中或通過移液器吸頭使沉澱通過幾次。可能需要在55-60 ℃下孵育10-15分鍾以溶解樣品。

 

特殊處理注意事項

 

STAT-60™含有刺激物(g ua nidinium)  並且可能是致命的。當與(yu)    STAT-60  使用  手套和護目鏡（護罩，  安全性  護目鏡）。請勿  得到  皮膚或衣服上。避免吸入蒸汽。閱讀瓶上的警告說明。請勿將 STAT-60暴露於(yu) 酸性環境中。

 

參考文獻

 

I. Chomczynks I. P.和  Sacchi,  1987.  單步  方法  的RNA Iso化通過酸性胍硫氰酸銨-苯酚l­氯方提取。生物技術8:14 8-1 49。

 

如有要求，可提供更多信息。

 

 

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