支原體(ti) 汙染一直是細胞生物學研究麵臨(lin) 的主要問題之一，因為(wei) 它們(men) 會(hui) 影響或改變細胞的生理機能。由於(yu) 其寄生特性和適應宿主細胞的能力，支原體(ti) 經常作為(wei) 汙染物出現在細胞培養(yang) 物中。 [1]
支原體(ti) 沒有細胞壁。出於(yu) 這個(ge) 原因，它們(men) 對靶向細菌細胞壁合成的抗生素（例如pen/strep）不敏感，這些抗生素通常用於(yu) 細胞培養(yang) 。細胞壁的缺乏以及它們(men) 的小尺寸（通常為(wei) 0.2 - 0.3 ?m）也使它們(men) 在傳(chuan) 統顯微鏡下的檢測變得複雜。它們(men) 的小尺寸和非常靈活的形式也意味著支原體(ti) 不能通過無菌過濾從(cong) 液體(ti) 介質中去除。
由於(yu) 缺乏宏觀效應，支原體(ti) 可能長期未被發現。特別是在使用標準抗生素的日常工作中，實驗室工作人員的支原體(ti) 汙染可能會(hui) 在很長一段時間內(nei) 未被發現，因為(wei) 其他細菌的汙染通過添加抗生素而被選擇性抑製，而同時引入的支原體(ti) 可以不受阻礙地繁殖。
鑒於(yu) 此，許多研究表明細胞培養(yang) 物的支原體(ti) 汙染水平高達 40% 也就不足為(wei) 奇了。這些高汙染水平的一個(ge) 可能原因被認為(wei) 是由實驗室工作人員、血清或胰蛋白酶、外來細胞培養(yang) 物（交叉汙染）或最終由收獲細胞培養(yang) 物的動物引入的。 [3]
文獻：
1. HG Drexler, C. Uphoff；Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. 照片：M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer：“Zell- und Gewebekultur"；Gustav Fischer 出版社，斯圖加特 (1987)；RJ Hay、ML Macy、TR Chen；Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]
由於(yu) 汙染的存在會(hui) 影響從(cong) 細胞培養(yang) 中獲得的結果的準確性，或者在最壞的情況下，會(hui) 損害細胞生長到整個(ge) 培養(yang) 物丟(diu) 失的程度，因此必須定期檢查細胞培養(yang) 物中是否存在支原體(ti) 汙染。特別是在細胞轉染中必須排除支原體(ti) 汙染，因為(wei) 汙染對細胞生長和代謝的負麵影響會(hui) 導致轉染效率急劇下降。
支原體(ti) 是軟體(ti) 菌類中的幾個(ge) 細菌屬之一。軟體(ti) 動物是人類、動物和植物的微小寄生蟲或共生體(ti) ；根據定義(yi) ，支原體(ti) 屬的 100 多種*物種僅(jin) 限於(yu) 脊椎動物宿主，在那裏它們(men) 被稱為(wei) 許多疾病的病原體(ti) （例如由肺炎支原體(ti) 引起的肺炎）。
細胞表麵支原體(ti) 菌落的電子顯微鏡圖像 [2]
支原體(ti) 細胞非常小，沒有細胞壁。因此，它們(men) 不受靶向細胞壁合成的抗生素的影響。支原體(ti) 的基因組大小範圍為(wei) 0.58 – 1.38 兆堿基對，GC 含量低 (18 – 40 mol%)，是所有具有自動複製能力的原核生物中最小的。
作為(wei) 需氧或兼性厭氧生物，支原體(ti) 與(yu) 其宿主理想地對齊，因此因此在細胞培養(yang) 物 (37°C) 中找到最佳生長條件。
...損害細胞生長
...降低宿主細胞的代謝活性
...調節細胞的細胞因子產(chan) 生
...在體(ti) 外誘導染色體(ti) 畸變
...通過標準無菌過濾器
...對抗生素如青黴素或鏈黴素具有抗性通常用於(yu) 細胞培養(yang)
...耐高溫和脫水
...影響轉染效率
支原體(ti) 可以在幾乎所有已知的細胞類型中增殖，因此無處不在。據估計，大約 80% 的日本細胞培養(yang) 物、65% 的阿根廷細胞培養(yang) 物和 15% 的美國細胞培養(yang) 物被支原體(ti) 汙染。該圖顯示了支原體(ti) 汙染對 HeLa 細胞生長的廣泛影響。
由於(yu) 支原體(ti) 汙染具有不可見且不會(hui) 導致細胞死亡的特殊特性，因此汙染可能會(hui) 在很長一段時間內(nei) 未被發現。然而，這些細菌對轉染成功有廣泛的影響：
• 由於(yu) 精氨酸需求增加，細胞生長顯著減少
• 支原體(ti) 調節細胞因子的產(chan) 生
• 支原體(ti) 導致染色體(ti) 畸變
• 支原體(ti) 滯留在細胞膜中，並可能調節細胞膜過程，例如內(nei) 吞作用。
所有這些操縱的生理過程也參與(yu) 轉染過程。該圖顯示了支原體(ti) 汙染對 HeLa 和 HepG2 細胞的廣泛影響：與(yu) 未汙染細胞相比，效率分別提高了 17% 和 5.6%。
在 48 孔板上用 pCMVßgal 轉染 HeLa 和 HepG2 細胞。通過 ONPG 和 BCA 分析評估比吸收值。左邊的條形顯示由支原體(ti) 汙染導致的轉染效率大大降低。
DAPI染色
在細胞培養(yang) 物中檢測支原體(ti) 的一個(ge) 流行應用是用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色細胞。DAPI 強烈嵌入 的小溝中，並在紫外線激發下在最大 460 nm 處顯示出相對較寬的熒光發射。在無支原體(ti) 細胞培養(yang) 中，僅(jin) 標記細胞核。如果存在支原體(ti) 細胞，它們(men) 的 也會(hui) 被標記。由於(yu) 它們(men) 的體(ti) 積小，單個(ge) 支原體(ti) 細胞無法在熒光顯微鏡下分辨：隻有高度汙染會(hui) 導致可見的模糊麵紗形成，這可能無法清楚地識別。
聚合酶鏈反應
更靈敏的支原體(ti) 檢測方法是 PCR。可以在非常早期的汙染和低濃度狀態下檢測細胞培養(yang) 物中的支原體(ti) 。這種檢測方法通常適用於(yu) 細胞培養(yang) 工作。
其他
雖然 ELISA 測試經常用於(yu) 支原體(ti) 的常規檢測，但這種方法在靈敏度和特異性方麵並不優(you) 於(yu) DAPI 測試。另一種方法是電子顯微鏡，然而，它需要先進的設備並且更耗時。
結論
為(wei) 確保細胞培養(yang) 物中支原體(ti) 汙染引起的諸多問題最終成為(wei) 過去，Biontex 提供了一係列基於(yu) PCR 的檢測支原體(ti) 檢測試劑盒：
MycoSPY®（常規 PCR 檢測試劑盒）
MycoSPY® Master Mix（ PCR 檢測試劑盒，包括 Master Mix 和用於(yu) 凝膠電泳的上樣緩衝(chong) 液和示蹤染料
該產(chan) 品對已建立的細胞係和原代細胞均取得了優(you) 異的結果。
 | |
用 DAPI 染色的 Cos7 細胞，無 | DAPI 染色未能揭示 |
 | |
當存在* 水平的支原體(ti) 汙染時，這些 DAPI 染色的 H441-Luc 細胞僅(jin) 在細胞外圍 | 所有這三種 |
| 方法 | DAPI-測試 | 酶聯免疫吸附試驗 | MycoSPY® | 電子顯微鏡 |
|---|---|---|---|---|
| 努力 | + | + | + | -- |
| 費用 | ++ | 0 | + | -- |
| 靈敏度 | -- | - | ++ | + |
| 全部的 | + | 0 | ++++ | --－ |
對於(yu) 被細菌汙染的細胞培養(yang) 物的處理，通常使用標準抗生素。但是作用於(yu) 細胞壁的抗生素（如青黴素）對支原體(ti) 無效。
因此，我們(men) 提供產(chan) 品MycoRAZOR®，這是一種抗生素混合物，可損害蛋白質生物合成（轉錄和翻譯）。
是的。重要的是檢查支原體(ti) 是否已被MycoRAZOR®（例如，通過使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）*消除，以防止產(chan) 生耐藥性。由於(yu) 耐藥性的產(chan) 生方式與(yu) 所有抗生素的使用方式相同，因此*消除支原體(ti) 至關(guan) 重要。
首先檢查是否在上次使用MycoRAZOR®和當前測試之間進行了兩(liang) 次未使用MycoRAZOR®的傳(chuan) 代。如果不是這種情況，則可能已檢測到死支原體(ti) ，特別是通過高度敏感的方法，例如 PCR。如果觀察到最後一次應用和測試之間的最短時間，請在接下來的五次細胞傳(chuan) 代中使用MycoRAZOR®，逐漸增加MycoRAZOR®的劑量，最大稀釋度為(wei) 1/25。請注意，根據細胞類型，增加MycoRAZOR®的濃度可能會(hui) 產(chan) 生毒性作用. 如果您在細胞中觀察到毒性作用（增殖率降低；細胞形態變化），請在剩餘(yu) 周期中使用最後一次使用的劑量。必須使用支原體(ti) 檢測試劑盒（例如MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）測試每種治療的結果！
細胞培養(yang) 中使用的動物產(chan) 品是支原體(ti) 汙染的主要來源。為(wei) 避免這種風險，請僅(jin) 使用保證不含支原體(ti) 的胎牛血清 (FBS) 和胰蛋白酶。
支原體(ti) 屬於(yu) Mollicutes 類，因此缺乏細胞壁，它們(men) 對許多攻擊細胞壁合成的抗生素具有抗性。因此，在將此類抗生素（例如青黴素/鏈黴素）用於(yu) 細胞培養(yang) 的常規使用中，使用者本身是重要的汙染源。在這種情況下，非無菌工作條件會(hui) 被忽視，因為(wei) 添加抗生素會(hui) 阻止大多數細菌的生長——從(cong) 而阻止宏觀效應——同時允許支原體(ti) 不受阻礙地繁殖。
此外，來自另一種細胞培養(yang) 物的交叉汙染是可能的。出於(yu) 這個(ge) 原因，始終測試所有培養(yang) 的細胞並更換任何可能被汙染的細胞培養(yang) 材料（培養(yang) 基、FBS、胰蛋白酶、緩衝(chong) 液）。
第MycoRAZOR®不包含任何doxy-或四環素類抗生素。
大多數基於(yu) PCR 的支原體(ti) 檢測試劑盒都包含一個(ge) 質粒作為(wei) 陽性對照，該質粒編碼支原體(ti) 的 16S rRNA。這確保了引物的功能。如果存在支原體(ti) 汙染，該質粒產(chan) 生的 擴增子的大小與(yu) 預期的相同或相似。因此，帶有陽性對照的 PCR 必須在單獨的管中進行。通常還包括內(nei) 部對照，以確保 PCR 不受來自細胞培養(yang) 上清液的蛋白質和細胞碎片的抑製。內(nei) 部對照產(chan) 生與(yu) 支原體(ti) 汙染的細胞樣本不同長度的 擴增子。因此，內(nei) 部控製可以在每種方法中進行。
MycoSPY® Master Mix試劑盒和MycoSPY®試劑盒中包含的內(nei) 部對照是一種質粒，它編碼支原體(ti) 16S rRNA 的縮短形式。因此，內(nei) 部對照用作陽性對照，並確保對於(yu) 每種 PCR 方法，細胞培養(yang) 上清液中不存在抑製劑。因此，它排除了假陰性結果。
兩(liang) 者MycoSPY®主混合物的試劑盒和MycoSPY®試劑盒檢測至少80份支原體(ti) 基因組的。內(nei) 部控製稍微降低了靈敏度。由於(yu) 支原體(ti) 在細胞培養(yang) 物受到汙染後繁殖相對較快，因此這種敏感性就足夠了。
因此，我們(men) 建議在每次 PCR 中添加內(nei) 部對照，以確保不存在來自細胞培養(yang) 上清液的任何現有抑製劑（蛋白質、細胞碎片）。
沒有必要避免使用常規抗生素，例如青黴素、鏈黴素或慶大黴素，因為(wei) 它們(men) 不會(hui) 抑製MycoSPY® Master Mix Kit 或MycoSPY®試劑盒的檢測。
是的。我們(men) 建議在 20°C 下儲(chu) 存，不含添加劑（例如 DMSO）。解凍後，應按照手冊(ce) 中的說明製備細胞培養(yang) 上清液。
我們(men) 建議將細胞培養(yang) 至少 48-72 小時，或直到生長區域的覆蓋率至少達到 80%。對於(yu) 懸浮細胞，細胞密度應大約在推薦用於(yu) 傳(chuan) 代培養(yang) 的細胞數範圍內(nei) 。由於(yu) 在細胞培養(yang) 上清液中檢測到支原體(ti) ，因此在此期間不應更換培養(yang) 基。
我們(men) 建議至少每 1-2 個(ge) 月進行一次支原體(ti) PCR（例如使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix），尤其是在存在抗生素（例如 pen/strep）的情況下培養(yang) 細胞時。這些抗生素可防止發現未消毒的工作技術，但會(hui) 導致細胞培養(yang) 物受到支原體(ti) 汙染。
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