殘留檢測試劑盒

疫苗殘留對人體的潛在危害

對所使用的疫苗，我們(men) zui關(guan) 心的是疫苗的效果和其安全性。現在很多疫苗是細胞培養(yang) 疫苗，比如重組（CHO細胞）乙肝疫苗，Vero細胞狂犬病疫苗等大多數疫苗都是用細胞培養(yang) 的方法生產(chan) ，而對疫苗的純化是關(guan) 鍵問題，我們(men) 要盡可能的去除宿主細胞和宿主蛋白。假若宿主細胞的和蛋白同疫苗一起注入人體(ti) 將會(hui) 產(chan) 生不可預料的後果。就以疫苗殘留為(wei) 例，疫苗殘留可能造成插入突變﹑導致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，zui終造成疫苗使用者致癌。

疫苗殘留的相關法規

由於(yu) 有如此潛在的危險性，所以許多機構對疫苗殘留製定了相關(guan) 標準，1986年世界衛生組織規定用細胞係生產(chan) 的疫苗殘留不能超過100 pg /支 ，而在1998年世界衛生組織認為(wei) 細胞係生產(chan) 的疫苗殘留不能超過10 ng /支，而在1997年美國藥品食品衛生監督局規定在美國使用的細胞係疫苗殘留不能超過10 pg /支，中國規定的細胞係疫苗殘留不能超過100 pg /支。

所以在疫苗生產(chan) 中要隨時對殘留進行檢測，以便知道每個(ge) 過程除掉殘留的能力。在每一批產(chan) 品中我們(men) 必須檢測殘留，所以我們(men) 必須運用敏感且行之有效的對殘留定量的檢測方法。通常規定每支疫苗殘留不能超過100 pg，也就大約等同於(yu) 17個(ge) 甚至更少CHO細胞基因組的含量，對如此微量的殘留進行檢測，所用的技術方法就必須相當敏感和穩定，現在對殘留定量的方法主要有以下三種：
1、分子雜交技術檢測殘留
2、基於(yu) 結合蛋白的方法（Threshold® immunoassay）檢測殘留
3、實時定量PCR法檢測殘留

分子雜交技術檢測殘留的原理和方法

分子雜交分析的基本原理是基於(yu) 探針檢測變性而且固定在硝-酸纖維素膜上的宿主細胞。這些探針可以不依賴宿主細胞來製備，例如用隨機引物製備探針。探針上標記酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由於(yu) 地高辛標記核酸探針，操作方便、靈敏度高，已標記的探針在4℃貯存可達兩(liang) 年之久，方便隨時應用，所以現在常采用地高辛標記核酸探針，用光標記法將光敏Dig標記到探針上，製成光敏-Dig-核酸探針，再與(yu) 固定在硝--酸膜上的靶核酸進行靶分子雜交，使之與(yu) 抗Dig-堿性磷酸酶結合，zui後可用不同的檢測方式進行檢測，發光檢測和顯色檢測均可，靈敏度可達10pg以下（表 1  三種殘留檢測方法的比較）。

基於結合蛋白的方法（Threshold® Immunoassay）檢測殘留的原理和方法

Threshold® Immunoassay分析係統是基於(yu) 兩(liang) 種序列非特異性蛋白，單鏈（ss）結合蛋白（SSB）和抗ss 的單抗。檢測的基本過程是當生物素—單鏈結合蛋白和尿素酶—抗ss 的單抗與(yu) 變性的宿主細胞結合zui終形成複合物，通過親(qin) 合素將此複合物連接到生物素—硝--酸纖維素膜，在通過洗滌所有非特異性的被洗脫掉，zui後放於(yu) 有尿素溶液的讀數儀(yi) ，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2 導致PH值發生變化，讀數儀(yi) 根據PH值的變化換算成的量，從(cong) 而達到檢測殘留含量的目的。

實時定量PCR法檢測殘留的原理和方法

熒光定量PCR是基於(yu) PCR擴增時，在加入一對引物的同時加入一個(ge) 特異性的熒光探針，產(chan) 物的增加可以通過熒光信號指示，通過實時監控PCR體(ti) 係中的熒光信號，對樣本中初始模板進行定量分析。定量PCR可實時檢測產(chan) 物量，通過加入已知濃度的標準樣品繪製標準曲線，然後根據待測樣品在標準曲線中的位置推算初始模板的濃度，從(cong) 而達到檢測殘留含量的目的。

三種檢測殘留方法的比較

3種方法用來檢測疫苗殘留都要對樣品進行相應的處理，這對zui終的結果的準確性至關(guan) 重要。而雜交相對對樣品的損失小，而用Q-PCR需要提取樣品的，損失較大。在我們(men) 選擇那種方法時我們(men) 要考慮它的穩定性，敏感性，成本等以至找到*的性價(jia) 比的方法（表 1），從(cong) 表1 我們(men) 不難發現使用分子雜交的方法是一種比較可行經濟實用的方法，目前國內(nei) 也主要是用此方法。

表 1  三種殘留檢測方法的比較

羅氏Roche DIG High Prime  Labeling and Detection Starter Kit II試劑盒產品簡介

產(chan) 品中文名稱：高效地高辛標記和檢測試劑盒II

羅氏應用科學部（Roche Applied Science）是zui早致力於(yu) 向用戶提供非放射標記技術的公司之一，讓更多的科研工作者們(men) 可以避免使用危險的放射性同位素。DIG High Prime  Labeling and Detection Starter Kit II（第二代）是由羅氏公司研發，並且是在DIG High Prime  Labeling and Detection Starter Kit I（*代）的基礎上優(you) 化升級的，具有更高的準確性、更好的靈敏度、操作時間更短等特點。自1995年地高辛產(chan) 品上市以來，盡管有定量PCR技術的應用，DIG係統仍然是非放射性高效標記—檢測技術的*，被廣泛地應用各種膜雜交及原位雜交技術中。

高效地高辛標記和檢測試劑盒II 圖片

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羅氏Roche DIG High Prime  Labeling and Detection Starter Kit II檢測原理

該產(chan) 品是用地高辛（地高辛：英文名Digoxigenin，簡稱DIG；又稱異羥基洋地黃毒甙元，是一種類固醇半抗原分子）標記的探針，應用於(yu) 分子雜交和隨後的化學發光檢測。檢測主要分三階段進行：1. 標記：根據隨機引物標記技術，生成DIG地高辛標記的探針。 2. 雜交：按照標準雜交方法進行，將地高辛標記的探針用於(yu) 核酸點雜交，可選擇帶正電的尼龍膜或純硝--酸纖維素膜作為(wei) 雜交膜。 3. 免疫學檢測：首先將標記有AP的地高辛抗體(ti) 與(yu) 雜交探針免疫結合；然後在477 nm波長下，通過檢測堿性磷酸酶與(yu) CSPD底物產(chan) 生的化學發光反應的數值，從(cong) 而達到免疫檢測的目的。

羅氏Roche DIG High Prime  Labeling and Detection Starter Kit II的顯著特點

★ Accurate and fast-----使用預混合的高效地高辛（DIG）標記的隨機引物可以縮短標記探針的操作時間，提高標記物的產(chan) 量。 
★ Sensitive-----在人類的複合物和植物基因組中，可以檢測到單個(ge) 拷貝的基因。 
★ Time-saving-----地高辛（DIG）標記的探針可以儲(chu) 存一年以上，雜交液可以反複使用3～5次（具體(ti) 要根據每次雜交過程中標記探針產(chan) 生信號的強弱來確定）。

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